Công nghệ nuôi cấy mô & tế bào thực vật - PGS-TSKH Lê Văn Hoàng

Công nghệ nuôi cấy mô & tế bào thực vật - PGS-TSKH Lê Văn Hoàng, Đại Học Đà Nẵng 2008. 

Phần 1. Nuôi cấy tế bào
Chương 1. Giới thiệu chung và lịch sử phát triển
Chương 2. Những khái niệm cơ bản
Chương 3.Thu nhận và nuôi cấy phôi in vitro
Chương 4. Nhân giống vô tính in vitro
Chương 5. Nuôi cấy giao tử, tạo cây đơn bội in vitro
Chương 6. Nuôi cấy tế bào trần
Chương 7. Nuôi cấy tế bào và chọn dòng tế bào
Chương 8. Nuôi cấy mô thực vật và vấn đề làm sạch vi rus ở thực vật
Chương 9. Một số phương pháp canh tác hiện đại

Phần 2. Chuyển gen ở thực vật bậc cao
Chương 1. Mở đầu
Chương 2. Chuyển gen ở thực vật bậc cao
Chương 3. Chuyển gen trong thực tế trồng trọt

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DOWNLOAD

Read More →

Giáo trình chọn giống cây trồng, GS. Vũ Đình Hòa, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội

Chia sẻ với các bạn giáo trình chọn giống cây trồng rất hay của GS. Vũ Đình Hòa, hi vọng các bạn sẽ học tập tốt hơn.
Download

Read More →

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật, Nguyễn Hoàng Lộc & Lê Việt Dũng

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật, Nguyễn Hoàng Lộc & Lê Việt Dũng, Viện Tài Nguyên Môi Trường Và Công Nghệ Sinh Học Đại Học Huế, 2009

DOWNLOAD

Read More →

Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật, GS. Trần Văn Minh

Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật, GS. Trần Văn Minh

MỞ ĐẦU
Phần 1. NUÔI CẤY TẾ BÀO
Chương 1. GIỚI THIỆU CHUNG VÀ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN
1.1. Giới thiệu chung
1.3 Sơ lược các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô
1.3.1. Nuôi cấy phôi
1.3.2. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
1.3.3. Nuôi cấy mô phân sinh
1.3.4. Nuôi cấy bao phấn
1.3.5. Nuôi cấy tế bào đơn 

1.3.6. Nuôi cấy protoplast
Chương 2. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN
2.1. Học thuyết tế bào
2.1.1. Tính toàn thế của tế bào (cell totipotency)
2.1.2. Thể bội và gen
2.1.3.Thể bào tử và thể giao tử
2.1.4. Sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính
2.2. Tế bào thực vật
2.2.1. Cấu trúc của tế bào thực vật
2.2.2. Các quá trình chức năng của tế bào
2.3. Thực vật
2.4. Phòng thí nghiệm
2.4.1. Các thiết bị , dụng cụ cần thiết của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô
2.4.2. Các thủ tục cơ bản trong phòng thí nghiệm:
2.5. Đảm bảo điều kiện vô trùng
2.5.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật
2.5.2.Khử trùng
2.6. Môi trường
2.6.1. Thành phần hoá học của các môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật
2.6.2. Độ pH môi trường
2.6.3. Các tác nhân làm rắn môi trường
2.7. Một số loại môi trường cơ bản
2.8. Một số thuật ngữ cơ bản trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Chương 3.THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY PHÔI IN VITRO
3.1.Phôi soma
3.1.1. Sự phát sinh phôi soma
3.1.2. Thiết lập hệ thống phát sinh phôi đồng nhất và hiệu suất cao
3.2. Tính bất hợp của giao tử trước và sau khi thụ tinh
3.2.1. Tính bất hợp của giao tử trước khi thụ tinh
3.2.2. Tính bất hợp giao tử sau khi thụ tinh
3.3. Thụ phấn in vitro
3.3.1. Phương pháp thụ phấn in vitro
3.3.2. Các nhân tố ảnh hưởng sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro
3.3.3. Ứng dụng của thụ phấn in vitro
....................

DOWNLOAD

Read More →

Gốm Calcium Phosphate và ứng dụng trong lĩnh vực ghép xương

Nguồn: Nhut-Biotech.Blogspot.Com

Đề tài tiểu luận môn Vật Liệu Y Sinh ngày 11/06/2014

Read More →

Thiết kế protein và dự đoán de novo protein

Bài chỉ mang tính chất tham khảo và do những gì Nhựt hiểu được từ nhiều nguồn

Theo định nghĩa, việc thiết kế protein là quá trình xây dựng các phân tử protein mới, bằng cách thiết kế một phân tử protein dựa trên các nguyên lý cơ bản nhất, hoặc sửa đổi cấu trúc của một protein đang có, nhằm mục đích:

- Nghiên cứu quá trình lắp ráp của các protein và các nhân tố của chuỗi sơ cấp tham gia vào sự cuộn xoắn, ổn định và thể hiện chức năng của chúng. Các đặc điểm này có thể được khảo sát bằng cách sửa đổi một hoặc nhiều amino acid đặc trưng theo một kiểu đã được định hướng trong protein và quan sát kết quả sau khi sản xuất phiên bản đã được sửa đổi. Thông thường các protein có trình tự tương tự không giống nhau hoàn toàn, tồn tại trong tự nhiên sẽ có các tính chất hơi khác nhau và người ta có thể dựa vào các trình tự khác nhau này để tiến hành những sửa đổi sau đó.

- Sản xuất các phân tử protein ổn định cho một mục đích công nghệ đặc biệt, tuy nhiên các phiên bản được tìm thấy trong tự nhiên không có các tính chất tối ưu cần thiết. Ví dụ: một enzyme có thể được xem như một phần của một quá trình công nghiệp nhưng một điểm đặc trưng của protein, chẳng hạn độ ổn định nhiệt hoặc là độ pH tối ưu cho hoạt tính xúc tác… không thể tương thích với quá trình đó. Các thay đổi amino acid có thể biến đổi enzyme này sao cho nó thực hiện chức năng tốt hơn trong môi trường mới.

Muốn công nghệ hóa một protein cần phải hiểu biết về các nguyên lý cấu trúc của protein đó và đặc điểm của nguyên liệu để thiết kế hợp lý, hoặc sửa đổi các tính chất mong muốn. Hơn nữa, công nghệ này phải có được các công cụ sản xuất và phân tích protein mong muốn. Các công cụ và nguyên lý cơ bản hiện nay đang được phát triển song song.

Việc thiết kế cấu trúc protein có thể tiến hành từ lúc ban đầu hoặc bằng cách làm biến tính trên một cấu trúc protein đã biết và trình tự của nó (hay còn gọi là protein redesign). Việc thiết kế protein hợp lý giúp việc dự đoán trình tự protein sẽ đưa ra những cấu trúc gấp đặc trưng. Những trình tự dự đoán này sau đó có thể được đánh giá bằng thực nghiệm thông qua các phương pháp như tổng hợp peptide, đột biết khu vực có định hướng hay tổng hợp gen nhân tạo.

Dự đoán de novo protein

Trong sinh tin học, việc dự đoán cấu trúc de novo protein đề cập đến quá trình thuật toán mà cấu trúc bậc ba của protein được dự đoán từ chuỗi amino acid bậc một của chúng. Đât là vấn đề nan giải chiếm nhiều thời gian nghiên cứu của các nhà khoa học mà hiện nay vẫn chưa được giải quyết. Ngày nay, một số phương pháp thành công cho phép dự đoán cấu trúc gấp của các vùng protein nhỏ lẻ trong vòng 1,5 angstrom của toàn bộ cấu trúc.

Thiết kế protein de novo là một công việc rất phức tạp. Về nguyên tắc, đối với một protein bất kỳ có n gốc amino acid thì khả năng sẽ có 2× 10n trình tự khác nhau. Các cơ sở dữ liệu về cấu trúc và trình tự protein cho thấy nhiều trình tự có thể được điều chỉnh sự cuộn xoắn tương tự nhau và chúng có thể thực hiện các chức năng tương tự. Vì thế, phương pháp tiếp cận ngược lại để chọn lựa số lần cuộn xoắn thích hợp và sau đó xác định trình tự nào cần thiết để tạo ra sự cuộn xoắn mong muốn và có chức năng liên quan thích hợp hơn. Dahiyat và Mayo (1997) đã mô tả các phương pháp máy tính để thiết kế các trình tự của vùng peptide. Chỉ khi có trình tự peptide thì protein mới có thể được xây dựng hoặc bằng tổng hợp peptide (nếu trình tự có kích thước vừa phải) hoặc bằng tổng hợp gen. Gần đây, các phương pháp khuếch đại PCR để tổng hợp gen thường được sử dụng nhất, để làm đầy và khuếch đại từng phần các oligonucleotide chồng lấp nhau (overlap extension).

Phương pháp de novo đòi hỏi nguồn lực tính toán lớn và do đó chỉ thực hiện đối với các protein tương đối nhỏ. Việc dự đoán cấu trúc protein lớn hơn đòi hỏi những thuật toán tốt hơn cũng như các nguồn lực máy tính mạnh mẽ hơn (như Ble Gene hoặc MDGRAPE-3) hay dự án tính toán phân tán (như Folding@home, Rosetta@home, the Human Proteome Foldin Project hay Nutritious Rice For The World). Mặc dù những rào cản cho việc tính toán rất lớn nhưng những lợi ích tiềm năng của hệ gen cấu trúc (bằng việc thực nghiệm hay dự đoán) cho các ứng dụng y học và thiết kế thuộc làm cho việc dự đoán cấu trúc de novo trở nên đầy hứa hẹn.

Hiện nay, khoảng cách giữa các chuỗi protein đã biến và các cấu trúc protein còn rất lớn. Vào đầu năm 2008, chỉ có khoảng 1% trình tự được liệt kê tại cơ sở dữ liệu UniKProtKB tương ứng với cấu trúc trong Ngân hàng dữ liệu Protein (PDB) và khoảng cách giữa chúng xấp xỉ là năm triệu. Kỹ thuật thực nghiệm để xác định cấu trúc bậc ba đã phải đối mặt với những thách thức quan trong trong khả năng xác định cấu trúc protein. Ví dụ, trong khi X-quang tinh thể học đã thành công trong trong việc kết tinh khoảng 80.000 protein cytosolic, và thành công một phần trong việc kết tinh màng tế bào khoảng 280.

Phương pháp dự đoán cấu trúc de novo protein cố gắng để dự đoán cấu trúc bậc ba từ trình tự acid amin dựa trên những nguyên tắc chung chi phối năng lương gấp protein và khuynh hướng thống kê các đặc tính hình dáng mà cấu trúc tự nhiên yêu cầu, mà không cần sử dụng các mẫu cụ thể. 

Nghiên cứu trong việc dự đoán cấu trúc de novo chủ yếu tập trung trong ba lĩnh vực: 

• Những protein đại diện có độ phân giải thấp hơn. 
• Các chức năng năng lương chính xác
• Phương pháp lấy mẫu hiệu quả.

Chuỗi Amino acid để xác định cấu trúc bậc ba protein

Đã có nhiều bằng chứng ủng hộ cho quan điểm rằng trình tự chuỗi acid amin bậc một chứa tất cả các thông tin cần cho cấu trúc không gian ba chiều tổng thể, điều này đã làm nên ý tưởng cho việc dữ đoán de novo protein là có cơ sở.

• -         Trước hết, những protein với các chức năng khác nhau luôn luôn có những trình tự amino acid khác nhau.
• -         Thứ hai, một vài loại bệnh khác nhau ở người như bệnh teo cơ Duchenne, có thể liên kết với việc mất chức năng protein là hậu quả từ việc thay đổi bất thường ở một amino acid nào đó ở cấu trúc bậc một.
• -         Thứ ba, những protein với các chức năng tương tự nhau trên nhiều loài khác nhau thường có những chuỗi amino acid tương tự nhau. Ví dụ, Ubiquitin là một protein có liên quan đến việc điều chỉnh sự thoái hóa của các protein khác, những chuỗi amino acid của nó gần như là giống nhau ở các loài xa nhau như Drosophila melanogaster và Homo sapiens.
• -         Thứ tư, thông qua thực nghiệm, người ta có thể suy luận rằng protein xoắn gấp không phải là một quá trình hoàn toàn ngãu nhiên và thông tin cần thiết cho việc xoắn gấp đó cần phải được mã hóa trong cấu trúc bậc một. Cho ví dụ, nếu chúng ta giả định rằng cứ mỗi một amino acid của 100 amino acid chứa trong một polypeptide nhỏ trung bình có thể có tới 10 hình dáng khác nhau, vậy thì sẽ có 10¹⁰⁰ hình dạng khác nhau chứa trong một polypeptide, Nếu một hình dáng mất 10^-13 giây để xác định thì sẽ mất tới 10¹⁷ năm để xác định tất các hình dạng có thể có trong mẫu. Tuy nhiên, các protein được xoắn gấp chính xác trong cơ thể trong khoảng thời gian ngắn trong hầu hết mọi lúc, điều đó có nghĩa rằng quá trình này không thể ngẫu nhiên, vì vậy, nó hoàn toàn có khả năng được mô hình hóa.

Một trong những bằng chứng mạnh mẽ nhất cho giả thiết rằng tất cả các thông tin liên quan đều cần thiết đễ mã hóa cấu trúc bậc ba của protein được tìm thấy trong chuỗi bậc một được chứng minh trong những năm 50 của thế kỷ trước do Christian Anfinsen. Trong một thí nghiệm kinh điển, ông đã cho thấy rằng ribonuclease A có thể bị biến tính hoàn toàn bằng ngâm trong dung dịch ure (để phá vỡ các liên kết kỵ nước bền vững) có sự hiện diện của các tác nhân khử (để tách các liên kết disulfide bền vững). Sau khi loại bỏ protein khỏi môi trướng này, protein tự hồi tính và phục hồi chức năng, chứng minh rằng cấu trúc bậc ba của protein được mã hóa trong cấu trúc chuỗi bậc một. Khi Protein hồi tính ngẫu nhiên thì trên một trăm tái tổ hộ khác nhau của 4 mạch disulfide có thể hình thành. Tuy nhiên, trong đa số trường hợp protein sẽ yêu cầu có sự hiện diện của phân tử chaperons trong tế bào cho việc xoắn gấp hợp lý. Hình dạng tổng thể của protein có thể được mã hóa trong cấu trúc amino acid của nó nhưng sự xoắn gấp có thể dựa trên sự hỗ trợ của chaperons.

Những yêu cầu cho một mô hình de novo protein thành công

Dự đoán cấu trúc de novo thường tiến hành bằng cách hình thành các hình dạng thử nghiệm (mồi) và sau đó lựa chọn dựa trên sự ổn định nhiệt và trạng thái năng lương. Hầu hết các dự đoán thành công sẽ phải có 3 yếu tố sau:

• Vùng chức năng năng lượng chính xác tương ứng với trạng thái nhiệt ổn định với cấu trúc bản địa của protein 
• Phương pháp tìm kiếm hiệu quả có khả năng xác định nhanh chống trạng thái năng lương yếu thông qua việc tìm kiếm hình dạng.
• Khả năng chọn lựa mô hình bản địa từ những cấu trúc mẫu

Hạn chế của dự đoán de novo protein

Hạn chế chính của phương pháp này là thời gian máy tính yêu cầu để xử lý thành công protein. Phương pháp phân tán như Rosetta@home đã cố gắng để cải thiện điều này bằng cách tuyển dụng những nhân viên tình nguyện có thời gian rảnh ở nhà để xử lý dữ liệu. Tuy vẫn thậm chí phải đối mặt với những thách thức ví dụ, phương pháp phân tán được dùng bởi một nhóm các nhà nghiên cứu tại đại học Washington và Viên Y Khoa Howard Hughes để dự đoán cấu trúc bậc ba của protein T0283 từ trình tự amino acid của nó. Trong một thử nghiệm người mù so sánh tính chính xác của kỹ thuật phân tán này với cấu trúc xác định được lưu trong Ngân hàng dữ liệu Protein (PDN), các nhà dự đoán đã đứa ra một kết quả tuyệt vời  so với cấu trúc được lưu trữ, tuy nhiên, thời gian và số lượng máy tính cần thiết cho chiến dạnh này là rất lớn : gần 2 năm trời và khoảng 70000 máy tính tại nhà.

Read More →

Thuật ngữ Latin trong sinh học

I. Ad libitum:

Về bản chất, “ad libitum” đóng vai trò như 1 tính từ.

Thường được dùng để nói về trọng lượng khi được nuôi ăn tự do (“free-feeding” weight) của một động vật, để so sánh với trọng lượng của chúng sau một bữa ăn bị giới hạn hoặc nuôi ăn theo cặp (pair feeding).

Ví dụ: “The rat’s ad libitum weight was about 320 grams”. Về khía cạnh dinh dưỡng học, câu này có nghĩa là con chuột nặng 320 grams sau khi người ta cho phép nó tiếp cận tự do với thức ăn và nước uống, và do đó cho phép nó tự điều hòa (self-regulate) lượng hấp thu (intake) theo nhu cầu sinh học (biological needs) bình thường của nó.

Trong lĩnh vực sinh học, “ad libitum” cũng có thể có nghĩa là thông tin hoặc dữ liệu có được một cách tự phát (spontaneously) mà không có phương pháp đặc biệt nào can thiệp vào.

Trong kê toa (medical prescriptions), các bác sĩ cũng dùng từ viết tắt “ad lib”. Lúc này “ad libitum” đồng nghĩa với “at one’s pleasure, as much as one desires”, để chỉ việc có thể ăn hoặc uống tự do nếu muốn.

Ví dụ: trong suốt đêm bệnh nhân được yêu cầu là không ăn gì cả nhưng có thể uống nước, bác sĩ sẽ viết y lệnh là “Water ad lib.” = Water as desired.

II. De novo synthesis:

De novo trong tiếng Latin, có nghĩa là “from the new”, “anew”, “from scratch”, “from the beginning”.

De novo synthesis có nghĩa là sự tổng hợp mới các phân tử phức tạp từ những phân tử đơn giản, như đường hay amino acids, trái nghĩa với sự tái tạo lại chúng (recycling) sau quá trình thoái giáng một phần (partial degradation).

Ví dụ: Formate và aspartate là những nucleotides không cần thiết trong khẩu phần ăn vì chúng có thể được cấu tạo từ những phân tử tiền chất nhỏ (small precursor molecules). Trong khi đó, methionine, cần phải có trong chế độ ăn vì nó không thể được tổng hợp mới (cannot be synthesized de novo) từ các phân tử tiền chất mà chỉ có thể bị thoái giáng và sau đó tái tạo lại từ homocysteine.

De novo synthesis cũng được dùng trong sự sao chép DNA (DNA replication) để chỉ sự tổng hợp mới một đoạn mồi từ DNA primase. DNA primase là một dạng của RNA polymerase, nó gắn với DNA helicase tạo một phức hợp gọi là primosome. Primase được hoạt hóa bởi DNA helicase mà tại đó nó tổng hợp một đoạn mồi RNA primer ngắn cho chuỗi làm khuôn mẫu, nhờ đó những nucleotides mới có thể được thêm vào bởi DNA polymerase và hoàn tất quá trình sao chép. Primase đóng vai trò quan trọng trong sự sao chép DNA vì tất cả DNA polymerase hiện được biết đều không thể tạo đoạn mồi, do đó cần phải có primase để tạo đoạn mồi mới (add the primer de novo).

 

III. Ex vivo:

Ex vivo (“out of the living”) để chỉ những sự việc xảy ra bên ngoài cơ thể sống. Trong khoa học, ex vivo đề cập đến những thử nghiệm (experimentation) hoặc phép đo (measurements) được thực hiện trong hoặc trên mô sống tách ra từ một cá thể sinh vật, trong một môi trường ngoại cảnh với sự thay đổi tối thiểu so với môi trường tự nhiên bên trong cơ thể. Thử nghiệm ex vivo trên những tế bào hoặc mô sống cho phép chúng ta kiểm soát và chủ động nhiều hơn so với thử nghiệm trong cơ thể sống (in vivo experiments).

Lợi ích chính của việc sử dụng các mô ex vivo là khả năng thực hiện các test và phép đo mà bình thường không thực hiện được vì không thể hoặc vì vấn đề đạo đức trên các cơ thể sống. Mô có thể được lấy đi bằng nhiều cách, bao gồm tách một phần, toàn cơ quan, hoặc thậm chí là hệ cơ quan.

Thuật ngữ ex vivo có nghĩa là các mẫu cần test được lấy từ sinh vật sống, ví dụ trường hợp của các tế bào ung thư lấy từ một mẫu máu, sau đó phát triển để tạo ra một mẫu chứng (control sample) và số lượng mẫu chứng tương ứng với số lượng test. Thuật ngữ in vitro (“within the glass”) nghĩa là các mẫu cần test được thu từ một kho lưu trữ, ví dụ trường hợp của các tế bào ung thư, một dòng tế bào sẽ tạo ra kết quả có lợi, sau đó phát triển để tạo ra một mẫu chứng và số lượng mẫu chứng tương ứng với số lượng test. Hai thuật ngữ này không đồng nghĩa mặc dù việc thử nghiệm trong cả hai trường hợp là “within the glass”. Các kết quả của ex vivo chỉ áp dụng được cho các sinh vật đã cho các tế bào để test, trong khi các kết quả của in vitro chỉ áp dụng cho dòng tế bào được sử dụng.

Trong sinh học tế bào, thủ thuật ex vivo thường liên quan đến các tế bào hoặc các mô sống lấy từ một sinh vật và nuôi cấy trong các thiết bị phòng thí nghiệm, thường trong điều kiện vô trùng và không có sự can thiệp nào trong 24 giờ để có được các tế bào đầy đủ cho các thử nghiệm. Thử nghiệm thường bắt đầu sau khi ủ 24 giờ, sử dụng tế bào hay mô sống từ các sinh vật tương tự vẫn được coi là ex vivo.

IV. In vitro:

Nghiên cứu in vitro (tiếng Latin: “in glass”) trong sinh học thực nghiệm là những nghiên cứu được tiến hành bằng cách sử dụng các thành phần (components) của một sinh vật đã được phân lập khỏi môi trường sinh học bình thường (usual biological surroundings) của chúng, nhằm cho phép phân tích chi tiết hơn hoặc thuận tiện hơn so với khi thực hiện phân tích toàn bộ sinh vật. Thông thường, những thí nghiệm này thường được gọi là “thí nghiệm trong ống nghiệm” (test tube experiments). Ngược lại, nghiên cứu in vivo là những nghiên cứu được tiến hành với các sinh vật sống trong trạng thái nguyên vẹn bình thường của chúng (normal intact state), trong khi nghiên cứu ex vivo là các nghiên cứu được tiến hành trên các cơ quan vẫn còn chức năng (functional organs) đã được loại bỏ khỏi cơ thể còn nguyên vẹn (intact organism).

Các ví dụ phổ biến về thử nghiệm in vitro bao gồm việc sử dụng:

(a) các tế bào có nguồn gốc từ sinh vật đa bào (multicellular organisms) (nuôi cấy tế bào hoặc nuôi cấy mô (cell culture or tissue culture))

(b) các thành phần dưới mức tế bào (ví dụ như ty thể (mitochondria) hoặc ribosomes)

(c) các chiết xuất từ tế bào hoặc dưới mức tế bào (ví dụ như mầm lúa mì hoặc chiết xuất hồng cầu lưới)

(d) các phân tử tinh khiết trong ống nghiệm (thường là protein, DNA, RNA hoặc riêng biệt hoặc kết hợp).

Ví dụ thực tế:

-Phản ứng PCR (Polymerase chain reaction) là một phương pháp để sao chép có chọn lọc (selective replication) các trình tự DNA và RNA cụ thể trong ống nghiệm.

-Sự thanh lọc protein (protein purification) bao gồm việc tách một protein đặc biệt mà chúng ta quan tâm khỏi hỗn hợp protein phức tạp, thường là lấy từ những tế bào hoặc mô đồng nhất (homogenized cells or tissues).

-Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization) cho phép tinh trùng (spermatozoa) thụ tinh với trứng trong một đĩa cấy (culture dish) trước khi cấy phôi (embryo) thu được vào trong tử cung của người mẹ.

-Chẩn đoán trong ống nghiệm (in vitro diagnostics) đề cập đến một loạt các test phòng thí nghiệm về y tế hoặc thú y (medical and veterinary laboratory tests) được sử dụng để chẩn đoán bệnh và theo dõi tình trạng lâm sàng (clinical status) của bệnh nhân bằng cách sử dụng các mẫu máu, tế bào hoặc mô khác lấy từ bệnh nhân.

      

In vitro fertilization

V. In vivo

In vivo (tiếng Latin: “within the living”) là thử nghiệm sử dụng toàn bộ cơ thể sống, khác với chỉ dùng một bộ phận của sinh vật sống hoặc dùng sinh vật chết, và cũng khác với môi trường in vitro (“within the glass”, có nghĩa là trong ống nghiệm hoặc đĩa petri). Thử nghiệm trên động vật (animal testing) và thử nghiệm lâm sàng (clinical trials) là 2 dạng của nghiên cứu in vivo. Thử nghiệm in vivo thường được dùng hơn so với in vitro bởi vì nó cho phép quan sát các tác động tổng thể của một thí nghiệm trên một cơ thể sống.

VI. In situ

In situ (tiếng Latin: “in position”) có nhiều nghĩa khác nhau tùy thuộc vào ngữ cảnh.

Trong sinh học và kỹ thuật y sinh (biomedical engineering), in situ có nghĩa là kiểm tra một hiện tượng (phenomenon) chính xác tại nơi nó xảy ra, tức là không di chuyển nó đến môi trường khác.

Ví dụ khi quan sát một động vật sống , có nghĩa là sinh vật này được quan sát và chụp ảnh trong môi trường hoang dã, chính xác tại nơi nó được tìm thấy chứ không phải là chuyển đến một vị trí khác (có thể thuận tiện hơn) như một hồ cá chẳng hạn.

Cụm từ in situ khi được sử dụng trong phòng thí nghiệm có thể mang nghĩa là một cái gì đó trung gian giữa in vivo và in vitro. Ví dụ, nghiên cứu một tế bào trong một cơ quan còn nguyên vẹn trong cơ thể và vẫn còn được tưới máu (perfusion) là một nghiên cứu in situ. Nó không được gọi là in vivo vì chúng ta chỉ xem xét một tế bào chứ không phải toàn bộ cơ thể, cũng không được gọi là in vitro vì chúng ta không phải chỉ làm việc với một mình tế bào đó.

Thử nghiệm in vitro là một trong những nỗ lực đầu tiên để phân tích số lượng và chất lượng các biến cố thực hiện trong phòng thí nghiệm . Tuy nhiên, hạn chế của thử nghiệm in vitro là chúng không được tiến hành trong môi trường tự nhiên . Để bù đắp cho bất lợi này, thử nghiệm in vivo cho phép thực hiện trong sinh vật sống hoặc môi trường tự nhiên. Làm trung gian, thử nghiệm in situ kết hợp lợi thế của in vivo là tiến hành trong môi trường tự nhiên của cơ thể và lợi thế của in vitro là người thực hiện có thể kiểm soát tốt quá trình làm thử nghiệm.

Trong y học, đặc biệt là ung thư học (oncology), ví dụ carcinoma, in situ có nghĩa là những tế bào ác tính hiện diện trong khối u (tumor), nằm dưới màng nền (basement membrane) tại nơi mà khối u được phát hiện, nhưng chưa di căn (metastasize) hay xâm lấn.

Đối với điều dưỡng học, in situ để chỉ những thiết bị được đặt trên cơ thể bệnh nhân tại vị trí tối ưu hoặc tại vị trí mà người bệnh mong muốn.

VII. In utero:

In utero (tiếng Latin: “in the womb”, “in the uterus”). Trong sinh học, cụm từ này mô tả tình trạng của một phôi (embryo) hoặc bào thai (fetus). Trong ngữ cảnh luật pháp, in utero đề cập đến trẻ em chưa được sinh ra (unborn children).

VIII. In silico:

Trong sinh học, in silico (tiếng Latin) có nghĩa là “performed on computer or via computer simulation“, được thực hiện trên máy tính hoặc thông qua sự mô phỏng trên máy tính.

Về genetics, trình tự gene kỹ thuật số (trên máy tính) (digital genetic sequences) thu được từ trình tự DNA có thể được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu trình tự (sequence databases), được phân tích, được thay đổi bằng kỹ thuật số và/hoặc được sử dụng như khuôn mẫu để tạo ra chuỗi DNA mới sử dụng cho việc tổng hợp gene nhân tạo.

Công nghệ mô hình dựa trên máy tính in silico có thể được áp dụng vào:

-Phân tích toàn bộ tế bào của các chủ thể prokaryote và eukaryote như E. coli, B. subtilis, nấm men, CHO- hoặc các dòng tế bào của con người…

-Thiết kế protein

Trong y học, người ta còn gọi là “in silico medicine”, hay “computational medicine”, là việc sử dụng trực tiếp các mô phỏng máy tính (computer simulation) trong chẩn đoán, điều trị và dự phòng một bệnh. Cụ thể hơn, in silico medicine ám chỉ việc mô hình hóa (modelling), mô phỏng (simulation) và trực quan (visualisation) những quá trình sinh học và y học trên máy tính.

IX. In natura:

In natura (tiếng Latin, “in nature”) là một cụm từ để mô tả những điều kiện có trong một môi trường không phải phòng thí nghiệm (non-laboratory environment), để phân biệt với môi trường in vivo (thử nghiệm trên cơ thể sống trong phòng thí nghiệm) và môi trường ex vivo (thử nghiệm trên tế bào cấy và phân lập khỏi cơ thể đa bào).

X. In papyro:

In papyro đề cập đến các thử nghiệm hoặc nghiên cứu chỉ thực hiện trên giấy. Ví dụ, thuật ngữ này có thể được áp dụng cho các nghiên cứu dịch tễ học không cần đến các đối tượng lâm sàng (clinical subjects).

Nguồn: AnhVanYKhoa.Com

Read More →

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật trong phân tích, kiểm nghiệm cần cho việc tăng sinh, phân lập, phân biệt, cấy truyền, bảo quản, định danh vi sinh vật, do đó, môi trường cần yêu cầu nghiêm ngặt và đầy đủ các thành phần về nguồn carbon, đạm, khoáng đa lượng và vi lượng.... cần thiết cho sự biến dưỡng về vật chất, năng lương của đối tượng vi sinh vật quan tâm.

Môi trường có thể được phân thành các loại khác nhau dựa theo 3 yếu tố:

1. Bản chất môi trường.
2. Tính chất vật lý
3. Công dụng môi trường

Ở phạm vi bài viết này, mình xin đề cập chuyên sâu hơn về phân loại môi trường dựa theo công dụng, vì đây là cách phân loại môi trường phổ biến nhất mà bạn sẽ gặp trong thực tế.

• Môi trường tiền tăng sinh (preenrichment media): là môi trường lỏng dùng để tăng sinh không có tính chọn lọc, làm giàu mật độ của vi sinh vật hiện diện trong mẫu. Loại môi trường này giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế tăng trưởng đặc hiệu, có tác dụng phục hồi và giúp sự tăng trưởng đồng thời của nhiều loài VSV.
• Môi trường tăng sinh (enrichment media): là môi trường lỏng dùng để tăng sinh chọn lọc đối tượng VSV cần kiểm nghiệm, ức chế tăng trưởng của các VSV khác do có chứa chất ức chế tăng trưởng đặc hiệu. Ví dụ MT tetrathionate là MT tăng sinh chọn lọc cho Salmonella.
• Môi trường chọn lọc (selective media): là môi trường rắn dùng phân lập chọn lọc các khuẩn lạc đơn của đối tượng VSV mục tiêu. Các môi trường phân lập khác nhau có mức độ chọn lọc khác nhau. Mức độ chọn lọc có thể kiểm soát bằng chất ức chế tăng trưởng, thành phần môi trường, nhiệt độ, oxy.... Ví dụ: Môi trường VCN là môi trường chọn lọc cho N. meningitidis
• Môi trường phân biệt (differential media): là môi trường rắn chọn lọc chứa các thành phần chỉ thị giúp cho sự phát hiện dễ dàng đối tượng vi sinh vật mục tiêu.
• Môi trường chọn lọc - phân biệt (selective - differential media): là môi trường kết hợp giữa công dụng chọn lọc và phân biệt nhờ sử dụng kết hợp các hóa chất khác nhau. Ví dụ môi trường Manitol Salt Agar chứa nồng độ cao của muối (7.5%) giúp sự tăng trưởng chọn lọc Staphylococcus trong khi ức chế sự tăng trưởng của đa số các VSV khác; mặt khác mantinol và chỉ thị pH trong môi trường giúp nhận diện các khuẩn lac Staphylococcus  dựa vào khả năng lên men manitol sinh acid làm đổi màu chỉ thị đỏ phenol.
• Môi trường thử nghiệm sinh hóa: là môi trường dùng để xác định một hoặc vài đặc điểm sinh hóa của chủng VSV đã được phân lập và làm thuần, tạo cơ sở để định danh chủng phân lập. Ví dụ MT MIR (Motility Indol Red) dùng để xác định tính di động, khả năng tạo indol và khả năng phân giải ure của một chủng phân lập.

Tham khảo từ Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm. Trần Linh Thước, NXB Giáo Dục, 2002.

Read More →

Nhuộm Gram - Phương pháp và ý nghĩa

Nguồn: https://mavuive.com/nhuom-gram-phuong-phap-va-y-nghia/

Số là hôm qua thi vấn đáp, giảng viên hỏi ngay phần này, ý nghĩa của từng loại thuốc nhuộm, dù đã làm đi làm lại cả trăm lần nhưng do không để ý và chuẩn bị kỹ nên trả lời sai phần chất tẩy cồn, bị mất điểm quá oan uổng, quyết định lên mạng tìm kiếm và học cho kỹ phần này để từ giờ về sau không phạm sai lầm nữa. Hy vọng mọi người cũng thế nhé!

Nhuộm Gram là một phương pháp nhằm phân loại vi khuẩn thành 2 nhóm lớn dựa vào cấu tạo thành tế bào khác nhau của chúng. Bằng phương pháp nhuộm Gram, ta có vi khuẩn Gram Âm (-) và vi khuẩn Gram Dương (+).
Tên gọi của phương pháp bắt nguồn từ người tìm ra nó, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853–1938), khi ông công bố phương pháp này vào năm 1884.
Đây là một phương pháp hữu hiệu trong bước đầu xác định vi sinh vật, tuy nhiên, không phải tất cả các loài vi khuẩn đều được phân chia bằng cách này, ta có nhóm vi khuẩn biến thể với Gram (gram-variable) và nhóm vi khuẩn không xác định Gram (gram-indeterminate).

Màu tím (Gram +) của vi khuẩn Staphylococcus aureus và màu đỏ hồng (Gram -)của Escherichia coli được phân biệt bằng phương pháp nhuộm Gram. (wikipedia.com)

Việc phân loại dựa trên cơ sở, các loài vi khuẩn Gram + có thành tế bào phủ lớp peptidoglycan dày (chiếm 50-90% vỏ tế bào), nên trong quá trình nhuộm, nó sẽ bắt màu của chất tím kết tinh (màu tím xanh), trong khi đó, nhóm vi khuẩn Gram - do có lớp peptidoglycan mỏng hơn (10%) nên nó không bắt được màu tím kết tinh mà sẽ bắt màu hồng của chất nhuộm Safranin. Các bước cơ bản của quá trình nhuộm Gram.

Lưu ý, quy trình mỗi nơi có thể khác nhau đôi chút nhưng đây là quy trình mà mình thường làm nhất

• -         Nhỏ lên lam kính sạch 1 giọt nước muối sinh lý, lấy 1-3 khuẩn lạc dàn đều trên lam kính và kéo một ít nước muối sinh lý vào để tránh làm loãng mẫu nhuộm.
• -         Để khô tự nhiên. Cố định tiêu bản trên phiến kính bằng cách hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn, kiểm tra độ nóng (nhẹ vừa phải trên mu bàn tay). Chú ý: nóng quá, hoặc hơ lâu, vi khuẩn sẽ biến dạng.
• -         Đổ thuốc nhuộm tím kết tinh lên tiêu bản, để 1 phút, rửa nước.
• -         Đổ dung dịch lugol lên tiêu bản, để 1 phút, hất bỏ đi.
• -         Tẩy màu bằng cồn 90⁰ cho tới khi không còn màu tím kết tinh.
• -         Rửa qua nước.
• -         Đổ thuốc nhuộm Safranin lên tiêu bản, để 30s.
• -         Rửa qua nước.
• -         Thấm giấy hoặc để khô ở không khí.
• -         Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100 có nhỏ dầu soi.
• 
  
• -         Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram dương bắt màu tím (do màu tím kết tinh) còn vi khuẩn Gram âm có màu đỏ hồng (đỏ Safranin).

Ý nghĩa từng bước: đọc ở: https://mavuive.com/nhuom-gram-phuong-phap-va-y-nghia/

Read More →

Từ điển dành cho dân công nghệ sinh học

Chào các bạn!
Hôm nay mình xin chia sẻ với các bạn 1 file pdf từ điển THUẬT NGỮ SINH HỌC ANH VIỆT của các tác giả MAI ĐÌNH YÊN, VŨ VĂN VỤ,LÊ ĐÌNH LƯƠNG.
Đây là file rất bổ ích và thích hợp theo ngành Sinh học và các ngành liên quan!. Mình cũng thường tra cứu từ điển này cho mỗi lần dịch bài và tìm kiếm thông tin!

Link:
DOWNLOAD

Read More →

Kỹ thuật kháng sinh đồ - Phạm Thái Bình

Tác giả: Phạm Thái Bình

Sơ lược: 
 - Thông số của kháng sinh
- Kháng sinh đồ bằng phương pháp xác định MIC
- Khánng sinh đồ bằng phương pháp đĩa kháng sinh
- Một số kháng sinh đồ đặc biệt
- Vấn đề chọn kháng sinh thực hiện kháng sinh đồ
- ß-Lactamase
- ß-Lactamase phổ rộng

DOWNLOAD

Read More →

Chuẩn bị Mueller-Hinton agar

(Vui lòng trích dẫn nguồn nhut-biotech.blogspot.com nếu chia sẻ)
 Mueller-Hinton agar là môi trường tăng trưởng vi sinh vật thường được sử dụng trong phương pháp khuếch tán kháng sinh cho các chủng Neisseria và Moraxella.Môi trường chứa hỗn hợp dịch chiết động vật (thường là bò), tinh bột, các casein giúp cho hầu hết các vi sinh vật phát triển.

Thành phần:

- 30% dịch chiết thịt (300gr/liter)

- 1.75% casein hydrolysate (17.5gr/liter)

- 0.15% tinh bột (1.5gr/liter)

- 1.7% agar (17gr/liter)

Chỉnh pH đến 7.3±0.1 ở nhiệt độ 25⁰C

Các pha:

1. Chuẩn bị các thành phần của MHA hoặc mua dạng bột bán ngoài thị trường.
2. Hấp khử trùng, để nguội còn khoảng 45⁰C tới 50⁰C trong nước.
3. Phân phối ra các đĩa petri với liều lượng 60-70mm/đĩa 15x150mm hoặc 25-30mm/đĩa 15x100mm sao cho độ dày xấp xỉ 4mm
4. Để môi trường khô tự nhiên
5. pH của môi trường nên nằm trong khoảng 7.2-7.4. Đừng cố điều chỉnh pH nếu nằm ngoài khoảng này.
6. Đặt các đĩa trong túi nhựa, ủ ở 4⁰C tới khi sử dụng.

Kiểm tra chất lượng

1. Sử dụng chủng chuẩn E. coli QC nuôi cấy trong 18-24 giờ trên đĩa MHA ở 35^-37⁰C với ~5% CO₂ (hoặc với đèn cầy).
2. Để kiểm tra vô trùng, tiến hành ủ chung với 1 đĩa đối chứng trong 48 giờ 35^-37⁰C với ~5% CO₂ (hoặc với đèn cầy).

Điều kiện đạt được:

-          Chủng E. coli phải mọc

-          Sau 48h, đĩa đối chứng vẫn không bị nhiễm

Chuẩn bị môi trường MHA với 5% máu cườu hoặc ngựa

1. Tiến hành tương tự như pha môi trường MHA cho tới bước 2
2. Bổ sung máu cừu (hoặc máu dê) tiệt trùng vào môi trường với nồng độ 5%.
   1. - Điều chỉnh pH của môi trường nằm trong khoảng 7.2 - 7.4. Lưu ý: Đừng cố điều chỉnh pH nếu pH nằm ngoài khoảng này.
   2. - Tiến hành phân phối ra đĩa petri có đáy phẳng, đặt trên mặt bàn phẳng để độ dày thạch là đồng nhất (4mm). Thường thì đổ 60-70ml môi trường đối với hộp 150mm đường kính, 25-30ml đối với hộp có đường kính 100mm.
   3. - Để môi trường khô tự nhiên sau đó tiến hành bảo quản trong túi nhựa, để tủ lạnh, dùng trong vòng 2 tuần.

Kiểm tra chất lượng

1. Nuôi cấy chủng chuẩn S. pneumoniae hoặc N. meningitidis QC trong 18-24 giờ trên đĩa MHA ở 35^-37⁰C với ~5% CO₂ (hoặc với đèn cầy).
2. Để kiểm tra vô trùng, tiến hành ủ chung với 1 đĩa đối chứng trong 48 giờ 35^-37⁰C với ~5% CO₂ (hoặc với đèn cầy).

Điều kiện đạt được:

-          S. pneumonia xuất hiện khuẩn lạc nhỏ, xám hoặc xanh xám xung quanh quầng sang xanh riêng biệt.

-          N. meningitidis xuất hiện khuẩn lạc lớn, tròn, mượt, sáng và lồi có màu xám giống như trên BAP

-          Sau 48h, đĩa đối chứng vẫn không bị nhiễm

 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. World Health Organization, Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae, 2011.

Read More →

Phương pháp khuếch tán kháng sinh cho N. meningitidis

(Vui lòng trích dẫn nguồn nhut-biotech.blogspot.com nếu chia sẻ)

1. Giới thiệu

Phương pháp khuếch tán kháng sinh trên thạch là phương pháp định tính và là một kỹ thuật có thể áp dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm vi sinh trong các bệnh viện và cho các trung tâm y tế dự phòng tuyến tỉnh.

Phương pháp dựa theo tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh. Đĩa kháng sinh được đặt trên môi trường thạch đã trải mầm cấy của chủng N.meningitidis. Sau khi đem ủ, quan sát xung quanh đĩa kháng sinh để theo dõi vòng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn đối với kháng sinh, dựa theo đường kính của vòng để xác định mức độ nhạy cảm của chủng đối với từng loại kháng sinh khác nhau.

Phương pháp được áp dụng để nhằm đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của chủng N. meningitidis để giúp cho việc lựa chọn các loại kháng sinh phủ hợp với bệnh nhân. Qua đó sẽ đưa ra các biện pháp nhằm khống chế và ngăn chặn sự lây lan của chủng kháng thuốc trong bệnh viện và cộng đồng.

2. Tiêu chuẩn
Dựa trên quy trình chuẩn được cung cấp bởi Viện chuẩn thức phòng thí nghiệm và lâm sàng CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).

3. Nguyên tắc

Một lượng kháng sinh thích hợp chúa trong đĩa kháng sinh được đặt trên thạch (thường sử dụng là thạch Meuler - Hilton (MH)) có chứa chủng vi khuẩn N. meningitidis, lượng kháng sinh sẽ khuếch tán vào thạch và được biểu hiện bằng các đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh giấy kháng sinh.

Nguyên tắc khuếch tán được giải thích như sau: Đĩa kháng sinh sẽ hấp thu nước từ môi trường thạch, kháng sinh hòa tan và bắt đầu khuếch tán vào thạch theo qui luật vật ký khuếch tán của các phân tử vào môi trường thạch, thực tế, sự khuếch tán phụ thuộc vào khối lượng phân tử, bản chất hóa học của kháng sinh và thành phần của môi trường nuôi cấy.

4. Các yếu tố ảnh hưởng

Để đánh giá chính xác mức độ nhạy cảm của N.meningitidis, cần kiếm tra những yếu tố sau:

4.1 Độ đục (đậm độ) mầm cấy

Đây được xem là yếu tố quan trọng nhất, nếu nồng độ không đúng với nồng độ Mc Farland chuẩn (thường là 0.5 tương đương với 10⁸ CFU/ml (CFU: colony forming unit)) sẽ ảnh hưởng tới kết quả. Vòng ức chế sẽ lớn hơn nếu đậm độ mầm cấy yếu (nhạt, thưa), và có thể cho kết quả nhạy cảm giả. Đậm độ cao, chủng trở nên đề kháng do sản sinh ra một số lượng lớn enzyme làm bất hoạt kháng sinh và cho phép vi khuẩn mọc. Đậm độ mầm cấy cũng ảnh hưởng đối với các kháng sinh tác động trên vách tế bào vi khuẩn.

4.2 Thành phần môi trường

Các thành phần như pH, lượng calcium, magnesium có trong môi trường cũng ảnh hưởng tới hoạt tính kháng sinh, có thể làm thay đổi kết quả của các phương pháp kháng sinh đồ. Ví dụ như pH phải nằm trong khoảng 7.2-7.4 sau khi đông. Nếu pH quá thấp sẽ làm giảm hoạt tính của kháng sinh nhóm aminiglycosides, quinolones và macrolides và có thể làm tăng hoạt tính của tetracyclines.

Một số lô môi trường MH chứa một lượng lớn thymine hoạch thymidine, có thể trung hòa hoạt tính của sulfamide, trimethoprime hoặc trimethoprime/sulfamethoxazole sẽ làm cho vòng ức chế trở nên nhỏ hơn hoặc không rõ ràng tạo nên kết quả kháng thuốc giả, trong khi vi khuẩn vẫn còn nhạy cảm.

4.3 Độ dày của thạch

Độ dày ảnh hưởng tới đường kính vòng ức chế. Để đảm bảo sự khuếch tán đồng đều kháng sinh, thạch cần có độ dành từ 3-4mm, thường là 4±0.5mm. Thạch quá mỏng sẽ hạn chết sự khuếch tán về phía bên dưới, do đó sự khuếch tán gia tăng ra bề mặt xung quanh đĩa kháng sinh và dẫn đến các vòng ức chế lớn hơn (kết quả nhạy cảm giả). Còn thạch quá dày thì làm kháng sinh khuếch tán nhanh chóng xuống dưới dáy và khi đó, vòng ức chế sẽ nhỏ hơn (kết quả kháng giả).

4.4 Hoạt tính kháng sinh

Đường kính vòng ức chế tỉ lệ với lượng kháng sinh có trong đĩa giấy thấm kháng sinh nên việc bảo quản khoanh giấy kháng sinh không đúng hoặc khoanh giấy quá hạn, hoạt tính kháng sinh có thể đã giảm. Đối với đa số kháng sinh, sự mất đi 50% hoạt tính sẽ làm vòng ức chế giảm bớt 2-3mm. Khi đặt đĩa kháng sinh vào thạch cần thao tác chính xác và cẩn thận, đảm bảo tiếp túc mặt thạch đồng đều để có sự khuếch tán kháng sinh tốt.

4.5 Nhiệt độ và điều kiện ủ

Các đĩa thạch kháng sinh đồ được đặt vào tủ ấm 35⁰C/16-20 giờ. Trong quá trình bảo quản đĩa kháng sinh, thao tác trước, trong và sau khi tiến hành kháng sinh đồ, cần đảm bảo về yếu tố thời gian và nhiệt độ chặt chẽ để thu được kết quả chính xác.

5. Quy trình và kỹ thuật

5.1 Loại mẫu:

Chủng N.meningitidis đã được phân lập và định danh từ các bệnh phẩm lâm sàng, trong các dịch và ở trong môi trường ngoại cảnh.

5.2 Thiết bị, dụng cụ:

- Tủ lạnh

- Tử ấm 37 độ.

- Máy vortex

- Thước đo vòng vô khuẩn

- Đèn cồn

- Que cấy

- Pipettet 1ml

- Kẹp vô trùng (pince)

- Tăm bông

- Ống nghiệm

5.3 Hóa chất, thuốc thử

5.3.1 Thạch Mueller -Hilton 5% máu

Là môi trường chuẩn cho kỹ thuật khuếch tán. Có thể tự pha hoặc sử dụng thạch MH bột đã được kiểm định chất lượng hiện đang được bán rộng rãi trên thị trường.

- Tiến hành pha theo nồng độ ghi trên chai.

- Tiến hành hấp khử trùng, rồi để nguội còn khoảng 45-50⁰C.

- Bổ sung máu cừu (hoặc máu dê) tiệt trùng vào môi trường với nồng độ 5%.

- Điều chỉnh pH của môi trường nằm trong khoảng 7.2 - 7.4. Lưu ý: Đừng cố điều chỉnh pH nếu pH nằm ngoài khoảng này.

- Tiến hành phân phối ra đĩa petri có đáy phẳng, đặt trên mặt bàn phẳng để độ dày thạch là đồng nhất (4mm). Thường thì đổ 60-70ml môi trường đối với hộp 150mm đường kính, 25-30ml đối với hộp có đường kính 100mm.

- Để môi trường khô tự nhiên sau đó tiến hành bảo quản trong túi nhựa, để tủ lạnh, dùng trong vòng 2 tuần.

5.3.2 Khoanh giấy kháng sinh

Sử dụng khoanh giấy kháng sinh của các hãng sản xuất có bán trên thị trường cho kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch.

Thực tiễn, không thể làm một kháng sinh đồ với tất cả các loại kháng sinh có trên thị trường, các kháng sinh có cấu trúc hóa học giống nhau được xếp vào cùng một gia đình (một họ) và chúng được xếp dựa vào phổ hoạt động, chọn lựa một kháng sinh đại diện cho nhóm và khái quát kết quả với các kháng sinh của cùng 1 nhóm.

Kháng sinh đại diện nhóm hay một họ là loại kém hoạt tính nhất của nhóm đó hay họ kháng sinh đó, một kết quả sai số, do đề kháng giả dễ được chấp nhận hơn là kết quả nhạy cảm giả. Tuy nhiên, với sự khác nhau hiện nay của các kháng sinh trong cùng họ, không phải luôn dễ dàng để chọn lựa duy nhất một kháng sinh đại diện cho một họ kháng sinh.

Việc lựa chon loại kháng sinh nào để kiểm tra còn tùy thuộc vào nguồn gốc chủng phân lập và khả năng của phòng thí nghiệm ở các vùng miền khác nhau trên thế giới. Đối với chủng N.menintigidis, ta cần chú ý giám sát đặc tính sản xuất Beta lactamase từ plasmid hoặc từ nhiễm sắc thể để kháng penicillin  hoặc nhóm cephem, và kháng ceftriaxone và chloramphenicol. Những dữ liệu này sẽ giúp cung cấp thông tin cho các cơ quan sức khỏe cộng đồng và là nguồn số liệu tham khảo để giám sát sự xuất hiện của các chủng kháng kháng sinh mới, giúp kịp thời ngăn chặn và có biện pháp xử lý.

Các ống chứa đĩa kháng sinh phải được bảo quản trong hộp riêng ở điều kiện khô ráo, ở 2-8⁰C hoặc đông sâu ở nhiệt độ dưới -4⁰C. Các penicillin và cephalosporine rất không bền, phải giữ đông sâu -14⁰C hoặc ở nhiệt độ thấp hơn nữa. Và khi được sử dụng, phải để trước ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ, chỉ mở hộp khi các đĩa kháng sinh đạt được nhiệt độ phòng thí nghiệm. Đây là điều tối cần thiết ngăn cản làm ẩm ướt đĩa kháng sinh.

5.3.3 Nước muối sinh lý

Có sẵn hoặc pha theo công thức:

NaCl:                                   8.5g

Nước cất 2 lần:                 1000 ml.

Hòa tan NaCl trong nước cất 2 lần. Tiến hành chỉnh pH=7, sấy khử trùng 121⁰C/15 phút. Để trong chai vặn kín để tránh bay hơi và để ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong vòng 6 tháng.

5.3.4 Độ đục chuẩn (McFarland):

Phải được chuẩn bị và kiểm định chất lượng trước khi làm thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh. Nếu độ đục chuẩn được hàn kín để chống bay hơi và bảo quản trong bóng tối thì có thể sử dụng trong 6 tháng. Độ đục chuẩn McFarland được sử dụng để điều chỉnh độ đục của huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn cho thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh.

Có thể mua hoặc tự pha bằng cách trộn:

Dung dịch BaCl₂.2H₂O 1%                       0.5 ml

Dung dịch H₂SO₄ 1%                                99.5 ml

Chia vào các tube và hàn kín để tránh bay hơi, các ống đục chuẩn này có thể giữ trong vòng 6 tháng trong bóng tối nhiệt ở độ phòng.

Lắc đều trước khi sử dụng để làm tan các hạt BaSO₄ kết tủa trong tube.

Kiểm tra độ chính xác của độ đục chuẩn 0,5 McFarland.

Đo bằng máy đo độ đục bước sóng 625nm: OD = 0,08-0,1.

Hoặc sử dụng chủng chuẩn E. coli ATCC 15922: điều chỉnh huyền dịch vi khuẩn giống với độ đục chuẩn, chuẩn bị các độ pha loãng 10 lần của huyền dịch, xác định số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm trên đĩa thạch. Huyền dịch vi khuẩn có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 phải có số lượng vi khuẩn là 10⁸vk/ml.

5.3.5 Chủng chuẩn quốc tế (ATCC)

- Escherichia coli ATCC 25922

- Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Giữ các chủng chuẩn ở -70⁰C trong môi trường canh thang LB 20%.

5.4. Quy trình

5.4.1 Chuẩn bị môi trường MH

Trước khi thực hiện kháng sinh đồ, đặt hộp thạch MH 30 phút/tủ ấm để mặt thạch khô.

5.4.2 Chuẩn bị mầm cấy

- Dùng que cấy vô trùng lấy 1 hay  2 khuẩn lạc hòa tan vào 1 ml nước muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng mát trộn Vortex.

- Tiến hành so sánh với độ đục chuẩn trên nền giấy trắng có kẻ các vạch đen

- Nếu huyền dịch vi khuẩn không có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 McFarland, có thể điều chỉnh độ đục bằng cách cho thêm nước muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn.

- Làm song song với 2 chủng chuẩn thử nghiệm là E. coli ATCC 25922 và S.pneumoniae ATCC 49619

- Mầm cấy sau khi chỉnh độ đục không được để quá 15-20 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm chưa trải ra hộp.

5.4.3 Trải mẫu lên đĩa thạch.

Dùng tăm bông trải mầm cấy lên mặt thạch như sau:

- Nhúng que gòn vào dung dịch vi khuẩn 10⁸CFU/ml

- Ép nhẹ và xoay tròn que gòn vào thành trong ống nghiệm để vắt bớt, loại bỏ lượng thừa.

- Trải mầm cấy 3 chiều, đảm bảo phân phối vi khuẩn đều khắp mặt thạch.

Sau khi trải mầm cấy, hộp thạch được giữ ở nhiệt độ phòng từ 5-10 phút để mặt thạch khô ráo, không được quá 15 phút trước khi đặt đĩa kháng sinh.

5.4.4 Đặt đĩa kháng sinh

Sử dụng kẹp vô khuẩn để đặt đĩa giấy kháng sinh lên mặt thạch, ấn nhẹ để có sự tiếp xúc tốt. Các đĩa kháng sinh đặt các rìa hộp thạch 15mm,  tâm 2 đĩa kháng sinh đặt cạnh nhau cách nhau ít nhất 24mm. Khi đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch thì không được dời sang vị trí khác vì đa số kháng sinh khuếch tán ngay khi tiếp xúc với mặt thạch.

Tùy theo kích thước của hộp thạch, kháng sinh mà ta có thể đặt số lượng đĩa kháng sinh khác nhau và thường không nên đặt quá 6 khoanh giấy lên đĩa thạch 90mm.

Để hộp thạch đã đặt đĩa kháng sinh ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 15 phút trước khi cho vào tủ ấm 35⁰C/16-18 giờ.

5.4.5 Đọc kết quả

Sau khi ủ đủ thời gian, lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi kích thước vòng vô khuẩn.

Vòng ức chế là vùng hoàn toàn không có sự tăng trưởng của vi khuẩn và vùng trung gian có những khuẩn lạc nhỏ bao xung quanh vùng ức chế. So sánh kết quả của chủng chuẩn với bảng chuẩn, nếu phù hợp nghĩa là qui trình thực hiện đúng, tiếp tục đọc kết quả vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm. Nếu không phù hợp, qui trình thực hiện chưa đúng hoặc hóa chất sinh phẩm hỏng, không phù hợp, cần phải tiến hành lại.

So sánh kích thước vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm với vòng ức chế chuẩn, sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh được thử nghiệm như là: Nhạy cảm (S - Susceptible), Kháng (R - Resistant), Trung gian (I - Intermediate).

Nếu có một hoặc nhiều khuẩn lạc trong vùng ức chế, phải chứng minh sự thuần khiết của chủng và độ chính xác của kỹ thuật, các khuẩn lạc này có thể là sự thay đổi tính kháng của vi khuẩn do các huyền dịch vi khuẩn bị trộn lẫn vào với nhau. Các khuẩn lạc này nên được nuôi cấy, phân lập và thử nghiệm lại tính nhạy cảm với kháng sinh

Bảng tiêu chuẩn đọc kết quả đường kính vùng ức chế đối với N.meningitidis của phương pháp khoanh giấy khuếch tán được khuyến cáo bởi CLSI 2011.

6. Kiểm tra chất lượng Để chứng minh mức độ chính xác của kỹ thuật, ta cần làm hằng ngày với các chủng chuẩn. Nếu trong 30 ngày liên tiếp, các kết quả đạt được cho thấy sự hằng định của kỹ thuật, các chủng tham khảo có thể được thực hiện một lần/tuần và mỗi khi có một lô môi trường mới, kháng sinh mới. Các chủng chuẩn quốc tế phải được thử nghiệm song song với các chủng thử nghiệm nhằm đảm bảo sự chính xác của kết quả Tuân thủ một cách chính xác qui trình xét nghiệm và phải kiểm tra chất lượng của từng loại môi trường sau khi pha và hoạt tính của đĩa kháng sinh bằng các chủng quốc tế.

 7. Yêu cầu về an toàn Phải tuân thủ đầy đủ qui tắc về an toàn sinh học khi làm việc với N.meningitidis như mặc áo blouse, găng tay và mang khẩu trang; không ăn uống hay mang thức ăn vào phòng xét nghiệp

  8. Chất thải phát sinh và phương pháp xử lý: Chất thải của qui trình xét nghiệm phải được cho vào các túi đựng các chất thải nguy hiểm hoặc cho vào phòng khử trùng và được hấp sấy ở 121⁰C trong vòng 15 phút.

 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh, Phương pháp khuếch tán kháng sinh.
2. Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương, Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán.
3. World Health Organization, Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae, 2011.

Read More →