Phương pháp khuếch tán kháng sinh cho N. meningitidis

(Vui lòng trích dẫn nguồn nhut-biotech.blogspot.com nếu chia sẻ)

1. Giới thiệu

Phương pháp khuếch tán kháng sinh trên thạch là phương pháp định tính và là một kỹ thuật có thể áp dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm vi sinh trong các bệnh viện và cho các trung tâm y tế dự phòng tuyến tỉnh.

Phương pháp dựa theo tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh. Đĩa kháng sinh được đặt trên môi trường thạch đã trải mầm cấy của chủng N.meningitidis. Sau khi đem ủ, quan sát xung quanh đĩa kháng sinh để theo dõi vòng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn đối với kháng sinh, dựa theo đường kính của vòng để xác định mức độ nhạy cảm của chủng đối với từng loại kháng sinh khác nhau.

Phương pháp được áp dụng để nhằm đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của chủng N. meningitidis để giúp cho việc lựa chọn các loại kháng sinh phủ hợp với bệnh nhân. Qua đó sẽ đưa ra các biện pháp nhằm khống chế và ngăn chặn sự lây lan của chủng kháng thuốc trong bệnh viện và cộng đồng.

2. Tiêu chuẩn
Dựa trên quy trình chuẩn được cung cấp bởi Viện chuẩn thức phòng thí nghiệm và lâm sàng CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).

3. Nguyên tắc

Một lượng kháng sinh thích hợp chúa trong đĩa kháng sinh được đặt trên thạch (thường sử dụng là thạch Meuler - Hilton (MH)) có chứa chủng vi khuẩn N. meningitidis, lượng kháng sinh sẽ khuếch tán vào thạch và được biểu hiện bằng các đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh giấy kháng sinh.

Nguyên tắc khuếch tán được giải thích như sau: Đĩa kháng sinh sẽ hấp thu nước từ môi trường thạch, kháng sinh hòa tan và bắt đầu khuếch tán vào thạch theo qui luật vật ký khuếch tán của các phân tử vào môi trường thạch, thực tế, sự khuếch tán phụ thuộc vào khối lượng phân tử, bản chất hóa học của kháng sinh và thành phần của môi trường nuôi cấy.

4. Các yếu tố ảnh hưởng

Để đánh giá chính xác mức độ nhạy cảm của N.meningitidis, cần kiếm tra những yếu tố sau:

4.1 Độ đục (đậm độ) mầm cấy

Đây được xem là yếu tố quan trọng nhất, nếu nồng độ không đúng với nồng độ Mc Farland chuẩn (thường là 0.5 tương đương với 10⁸ CFU/ml (CFU: colony forming unit)) sẽ ảnh hưởng tới kết quả. Vòng ức chế sẽ lớn hơn nếu đậm độ mầm cấy yếu (nhạt, thưa), và có thể cho kết quả nhạy cảm giả. Đậm độ cao, chủng trở nên đề kháng do sản sinh ra một số lượng lớn enzyme làm bất hoạt kháng sinh và cho phép vi khuẩn mọc. Đậm độ mầm cấy cũng ảnh hưởng đối với các kháng sinh tác động trên vách tế bào vi khuẩn.

4.2 Thành phần môi trường

Các thành phần như pH, lượng calcium, magnesium có trong môi trường cũng ảnh hưởng tới hoạt tính kháng sinh, có thể làm thay đổi kết quả của các phương pháp kháng sinh đồ. Ví dụ như pH phải nằm trong khoảng 7.2-7.4 sau khi đông. Nếu pH quá thấp sẽ làm giảm hoạt tính của kháng sinh nhóm aminiglycosides, quinolones và macrolides và có thể làm tăng hoạt tính của tetracyclines.

Một số lô môi trường MH chứa một lượng lớn thymine hoạch thymidine, có thể trung hòa hoạt tính của sulfamide, trimethoprime hoặc trimethoprime/sulfamethoxazole sẽ làm cho vòng ức chế trở nên nhỏ hơn hoặc không rõ ràng tạo nên kết quả kháng thuốc giả, trong khi vi khuẩn vẫn còn nhạy cảm.

4.3 Độ dày của thạch

Độ dày ảnh hưởng tới đường kính vòng ức chế. Để đảm bảo sự khuếch tán đồng đều kháng sinh, thạch cần có độ dành từ 3-4mm, thường là 4±0.5mm. Thạch quá mỏng sẽ hạn chết sự khuếch tán về phía bên dưới, do đó sự khuếch tán gia tăng ra bề mặt xung quanh đĩa kháng sinh và dẫn đến các vòng ức chế lớn hơn (kết quả nhạy cảm giả). Còn thạch quá dày thì làm kháng sinh khuếch tán nhanh chóng xuống dưới dáy và khi đó, vòng ức chế sẽ nhỏ hơn (kết quả kháng giả).

4.4 Hoạt tính kháng sinh

Đường kính vòng ức chế tỉ lệ với lượng kháng sinh có trong đĩa giấy thấm kháng sinh nên việc bảo quản khoanh giấy kháng sinh không đúng hoặc khoanh giấy quá hạn, hoạt tính kháng sinh có thể đã giảm. Đối với đa số kháng sinh, sự mất đi 50% hoạt tính sẽ làm vòng ức chế giảm bớt 2-3mm. Khi đặt đĩa kháng sinh vào thạch cần thao tác chính xác và cẩn thận, đảm bảo tiếp túc mặt thạch đồng đều để có sự khuếch tán kháng sinh tốt.

4.5 Nhiệt độ và điều kiện ủ

Các đĩa thạch kháng sinh đồ được đặt vào tủ ấm 35⁰C/16-20 giờ. Trong quá trình bảo quản đĩa kháng sinh, thao tác trước, trong và sau khi tiến hành kháng sinh đồ, cần đảm bảo về yếu tố thời gian và nhiệt độ chặt chẽ để thu được kết quả chính xác.

5. Quy trình và kỹ thuật

5.1 Loại mẫu:

Chủng N.meningitidis đã được phân lập và định danh từ các bệnh phẩm lâm sàng, trong các dịch và ở trong môi trường ngoại cảnh.

5.2 Thiết bị, dụng cụ:

- Tủ lạnh

- Tử ấm 37 độ.

- Máy vortex

- Thước đo vòng vô khuẩn

- Đèn cồn

- Que cấy

- Pipettet 1ml

- Kẹp vô trùng (pince)

- Tăm bông

- Ống nghiệm

5.3 Hóa chất, thuốc thử

5.3.1 Thạch Mueller -Hilton 5% máu

Là môi trường chuẩn cho kỹ thuật khuếch tán. Có thể tự pha hoặc sử dụng thạch MH bột đã được kiểm định chất lượng hiện đang được bán rộng rãi trên thị trường.

- Tiến hành pha theo nồng độ ghi trên chai.

- Tiến hành hấp khử trùng, rồi để nguội còn khoảng 45-50⁰C.

- Bổ sung máu cừu (hoặc máu dê) tiệt trùng vào môi trường với nồng độ 5%.

- Điều chỉnh pH của môi trường nằm trong khoảng 7.2 - 7.4. Lưu ý: Đừng cố điều chỉnh pH nếu pH nằm ngoài khoảng này.

- Tiến hành phân phối ra đĩa petri có đáy phẳng, đặt trên mặt bàn phẳng để độ dày thạch là đồng nhất (4mm). Thường thì đổ 60-70ml môi trường đối với hộp 150mm đường kính, 25-30ml đối với hộp có đường kính 100mm.

- Để môi trường khô tự nhiên sau đó tiến hành bảo quản trong túi nhựa, để tủ lạnh, dùng trong vòng 2 tuần.

5.3.2 Khoanh giấy kháng sinh

Sử dụng khoanh giấy kháng sinh của các hãng sản xuất có bán trên thị trường cho kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch.

Thực tiễn, không thể làm một kháng sinh đồ với tất cả các loại kháng sinh có trên thị trường, các kháng sinh có cấu trúc hóa học giống nhau được xếp vào cùng một gia đình (một họ) và chúng được xếp dựa vào phổ hoạt động, chọn lựa một kháng sinh đại diện cho nhóm và khái quát kết quả với các kháng sinh của cùng 1 nhóm.

Kháng sinh đại diện nhóm hay một họ là loại kém hoạt tính nhất của nhóm đó hay họ kháng sinh đó, một kết quả sai số, do đề kháng giả dễ được chấp nhận hơn là kết quả nhạy cảm giả. Tuy nhiên, với sự khác nhau hiện nay của các kháng sinh trong cùng họ, không phải luôn dễ dàng để chọn lựa duy nhất một kháng sinh đại diện cho một họ kháng sinh.

Việc lựa chon loại kháng sinh nào để kiểm tra còn tùy thuộc vào nguồn gốc chủng phân lập và khả năng của phòng thí nghiệm ở các vùng miền khác nhau trên thế giới. Đối với chủng N.menintigidis, ta cần chú ý giám sát đặc tính sản xuất Beta lactamase từ plasmid hoặc từ nhiễm sắc thể để kháng penicillin  hoặc nhóm cephem, và kháng ceftriaxone và chloramphenicol. Những dữ liệu này sẽ giúp cung cấp thông tin cho các cơ quan sức khỏe cộng đồng và là nguồn số liệu tham khảo để giám sát sự xuất hiện của các chủng kháng kháng sinh mới, giúp kịp thời ngăn chặn và có biện pháp xử lý.

Các ống chứa đĩa kháng sinh phải được bảo quản trong hộp riêng ở điều kiện khô ráo, ở 2-8⁰C hoặc đông sâu ở nhiệt độ dưới -4⁰C. Các penicillin và cephalosporine rất không bền, phải giữ đông sâu -14⁰C hoặc ở nhiệt độ thấp hơn nữa. Và khi được sử dụng, phải để trước ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ, chỉ mở hộp khi các đĩa kháng sinh đạt được nhiệt độ phòng thí nghiệm. Đây là điều tối cần thiết ngăn cản làm ẩm ướt đĩa kháng sinh.

5.3.3 Nước muối sinh lý

Có sẵn hoặc pha theo công thức:

NaCl:                                   8.5g

Nước cất 2 lần:                 1000 ml.

Hòa tan NaCl trong nước cất 2 lần. Tiến hành chỉnh pH=7, sấy khử trùng 121⁰C/15 phút. Để trong chai vặn kín để tránh bay hơi và để ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong vòng 6 tháng.

5.3.4 Độ đục chuẩn (McFarland):

Phải được chuẩn bị và kiểm định chất lượng trước khi làm thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh. Nếu độ đục chuẩn được hàn kín để chống bay hơi và bảo quản trong bóng tối thì có thể sử dụng trong 6 tháng. Độ đục chuẩn McFarland được sử dụng để điều chỉnh độ đục của huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn cho thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh.

Có thể mua hoặc tự pha bằng cách trộn:

Dung dịch BaCl₂.2H₂O 1%                       0.5 ml

Dung dịch H₂SO₄ 1%                                99.5 ml

Chia vào các tube và hàn kín để tránh bay hơi, các ống đục chuẩn này có thể giữ trong vòng 6 tháng trong bóng tối nhiệt ở độ phòng.

Lắc đều trước khi sử dụng để làm tan các hạt BaSO₄ kết tủa trong tube.

Kiểm tra độ chính xác của độ đục chuẩn 0,5 McFarland.

Đo bằng máy đo độ đục bước sóng 625nm: OD = 0,08-0,1.

Hoặc sử dụng chủng chuẩn E. coli ATCC 15922: điều chỉnh huyền dịch vi khuẩn giống với độ đục chuẩn, chuẩn bị các độ pha loãng 10 lần của huyền dịch, xác định số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm trên đĩa thạch. Huyền dịch vi khuẩn có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 phải có số lượng vi khuẩn là 10⁸vk/ml.

5.3.5 Chủng chuẩn quốc tế (ATCC)

- Escherichia coli ATCC 25922

- Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Giữ các chủng chuẩn ở -70⁰C trong môi trường canh thang LB 20%.

5.4. Quy trình

5.4.1 Chuẩn bị môi trường MH

Trước khi thực hiện kháng sinh đồ, đặt hộp thạch MH 30 phút/tủ ấm để mặt thạch khô.

5.4.2 Chuẩn bị mầm cấy

- Dùng que cấy vô trùng lấy 1 hay  2 khuẩn lạc hòa tan vào 1 ml nước muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng mát trộn Vortex.

- Tiến hành so sánh với độ đục chuẩn trên nền giấy trắng có kẻ các vạch đen

- Nếu huyền dịch vi khuẩn không có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 McFarland, có thể điều chỉnh độ đục bằng cách cho thêm nước muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn.

- Làm song song với 2 chủng chuẩn thử nghiệm là E. coli ATCC 25922 và S.pneumoniae ATCC 49619

- Mầm cấy sau khi chỉnh độ đục không được để quá 15-20 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm chưa trải ra hộp.

5.4.3 Trải mẫu lên đĩa thạch.

Dùng tăm bông trải mầm cấy lên mặt thạch như sau:

- Nhúng que gòn vào dung dịch vi khuẩn 10⁸CFU/ml

- Ép nhẹ và xoay tròn que gòn vào thành trong ống nghiệm để vắt bớt, loại bỏ lượng thừa.

- Trải mầm cấy 3 chiều, đảm bảo phân phối vi khuẩn đều khắp mặt thạch.

Sau khi trải mầm cấy, hộp thạch được giữ ở nhiệt độ phòng từ 5-10 phút để mặt thạch khô ráo, không được quá 15 phút trước khi đặt đĩa kháng sinh.

5.4.4 Đặt đĩa kháng sinh

Sử dụng kẹp vô khuẩn để đặt đĩa giấy kháng sinh lên mặt thạch, ấn nhẹ để có sự tiếp xúc tốt. Các đĩa kháng sinh đặt các rìa hộp thạch 15mm,  tâm 2 đĩa kháng sinh đặt cạnh nhau cách nhau ít nhất 24mm. Khi đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch thì không được dời sang vị trí khác vì đa số kháng sinh khuếch tán ngay khi tiếp xúc với mặt thạch.

Tùy theo kích thước của hộp thạch, kháng sinh mà ta có thể đặt số lượng đĩa kháng sinh khác nhau và thường không nên đặt quá 6 khoanh giấy lên đĩa thạch 90mm.

Để hộp thạch đã đặt đĩa kháng sinh ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 15 phút trước khi cho vào tủ ấm 35⁰C/16-18 giờ.

5.4.5 Đọc kết quả

Sau khi ủ đủ thời gian, lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi kích thước vòng vô khuẩn.

Vòng ức chế là vùng hoàn toàn không có sự tăng trưởng của vi khuẩn và vùng trung gian có những khuẩn lạc nhỏ bao xung quanh vùng ức chế. So sánh kết quả của chủng chuẩn với bảng chuẩn, nếu phù hợp nghĩa là qui trình thực hiện đúng, tiếp tục đọc kết quả vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm. Nếu không phù hợp, qui trình thực hiện chưa đúng hoặc hóa chất sinh phẩm hỏng, không phù hợp, cần phải tiến hành lại.

So sánh kích thước vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm với vòng ức chế chuẩn, sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh được thử nghiệm như là: Nhạy cảm (S - Susceptible), Kháng (R - Resistant), Trung gian (I - Intermediate).

Nếu có một hoặc nhiều khuẩn lạc trong vùng ức chế, phải chứng minh sự thuần khiết của chủng và độ chính xác của kỹ thuật, các khuẩn lạc này có thể là sự thay đổi tính kháng của vi khuẩn do các huyền dịch vi khuẩn bị trộn lẫn vào với nhau. Các khuẩn lạc này nên được nuôi cấy, phân lập và thử nghiệm lại tính nhạy cảm với kháng sinh

Bảng tiêu chuẩn đọc kết quả đường kính vùng ức chế đối với N.meningitidis của phương pháp khoanh giấy khuếch tán được khuyến cáo bởi CLSI 2011.

6. Kiểm tra chất lượng Để chứng minh mức độ chính xác của kỹ thuật, ta cần làm hằng ngày với các chủng chuẩn. Nếu trong 30 ngày liên tiếp, các kết quả đạt được cho thấy sự hằng định của kỹ thuật, các chủng tham khảo có thể được thực hiện một lần/tuần và mỗi khi có một lô môi trường mới, kháng sinh mới. Các chủng chuẩn quốc tế phải được thử nghiệm song song với các chủng thử nghiệm nhằm đảm bảo sự chính xác của kết quả Tuân thủ một cách chính xác qui trình xét nghiệm và phải kiểm tra chất lượng của từng loại môi trường sau khi pha và hoạt tính của đĩa kháng sinh bằng các chủng quốc tế.

 7. Yêu cầu về an toàn Phải tuân thủ đầy đủ qui tắc về an toàn sinh học khi làm việc với N.meningitidis như mặc áo blouse, găng tay và mang khẩu trang; không ăn uống hay mang thức ăn vào phòng xét nghiệp

  8. Chất thải phát sinh và phương pháp xử lý: Chất thải của qui trình xét nghiệm phải được cho vào các túi đựng các chất thải nguy hiểm hoặc cho vào phòng khử trùng và được hấp sấy ở 121⁰C trong vòng 15 phút.

 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh, Phương pháp khuếch tán kháng sinh.
2. Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương, Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán.
3. World Health Organization, Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae, 2011.